May 08, 2023
Мульти
Том коммуникативной биологии
Биология связи, том 6, Номер статьи: 525 (2023) Цитировать эту статью
722 доступа
2 Альтметрика
Подробности о метриках
Эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) образуют динамический интерфейс между кровью и тканями и играют решающую роль в прогрессировании воспаления сосудов. Здесь мы стремимся проанализировать общесистемные молекулярные механизмы воспалительных эндотелиально-цитокиновых реакций. Применяя объективную библиотеку цитокинов, мы определили, что TNFα и IFNγ вызывают наибольший ответ EC, что приводит к отчетливым протеомным воспалительным признакам. Примечательно, что комбинированная стимуляция TNFα + IFNγ вызывала дополнительный синергетический воспалительный признак. Мы применили мультиомический подход для анализа этих воспалительных состояний, объединив (фосфо-)протеом, транскриптом и секретом, и обнаружили, в зависимости от стимула, широкий спектр измененных иммуномодулирующих процессов, включая белки комплемента, комплексы MHC и различные секреторные цитокины. Синергия привела к совместной активации индукции транскриптов. В этом ресурсе описаны сложные молекулярные механизмы, лежащие в основе эндотелиального воспаления, и подтверждается адаптивная иммуномодулирующая роль эндотелия в защите хозяина и воспалении сосудов.
Эндотелиальные клетки (ЭК) выстилают внутреннюю часть наших кровеносных сосудов и образуют динамический интерфейс между кровью и окружающими тканями. Помимо облегчения обмена кислорода, питательных веществ и продуктов обмена, ЭК контролируют гемостаз, привлекая тромбоциты для закрытия повреждений в сосудистых стенках во время первичного гемостаза1. Более того, ЭК являются важными «привратниками», контролирующими перемещение иммунных клеток в ткани и из них во время воспаления. Благодаря своей роли в этом адаптивном синапсе ЭК хорошо приспособлены для восприятия сигналов окружающей среды, таких как механический стресс, гормоны (например, вазопрессин, гистамин), клетки (например, нейтрофилы, моноциты, тромбоциты) и другие внешние стимулы (например, тромбин). , цитокины)2,3,4,5. Помимо трансмиграции иммунных клеток, ЭК обладают рядом иммуномодулирующих способностей, таких как презентация антигена и секреция цитокинов5,6. Однако, хотя ЭК обладают этими иммуномодулирующими свойствами и являются одними из первых клеток, вступающих в контакт с патогенами, они редко упоминаются в сетях иммунных клеток7,8,9.
Нарушение регуляции гомеостаза ЭК может привести к состояниям чрезмерного воспаления или гиперкоагуляции эндотелия. Эта эндотелиальная дисфункция связана с несколькими многогранными воспалительными заболеваниями, включая острое повреждение легких, связанное с переливанием крови, сепсис, ревматоидный артрит, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), глазные васкулопатии, хроническое заболевание почек и COVID-1910,11,12,13, 14,15,16,17,18,19.
Хотя при этих заболеваниях нарушается регуляция эндотелиального гомеостаза и цитокинов, молекулярная основа, которая управляет адаптивными эндотелиально-цитокиновыми взаимодействиями, в основном ограничивается исследованиями фактора некроза опухоли-альфа (TNFα). Более того, синергизм между цитокинами, такими как TNFα и интерферон-гамма (IFNy), наблюдался в ЭК и связан с пагубными эффектами при воспалительных заболеваниях20,21,22,23. Хотя основные механизмы были предложены, общесистемная реакция ЕС не была охарактеризована.
Поэтому в этом исследовании мы решили проанализировать молекулярные характеристики эндотелиально-цитокиновых ответов, используя эндотелиальные клетки, выросшие из крови (BOEC), также известные как эндотелиальные колониеобразующие клетки, в качестве нашего источника ЭК из-за их обширного и устойчивого размножения. экспрессия зрелых маркеров ЭК сосудов и возможность их выделения от взрослых доноров24,25.
Мы показываем, что ЭК экспрессируют репертуар рецепторов для облегчения различных цитокиновых сигналов. Однако при стимуляции объективной библиотекой цитокинов мы наблюдали преимущественно уникальные воспалительные состояния для TNFα и IFNγ. Более того, комбинированная стимуляция TNFα и IFNγ приводила к синергетическому ответу EC. Объединив несколько уровней омики, мы проанализировали молекулярную основу этих воспалительных состояний от передачи сигналов (фосфопротеом) до транскрипции мРНК (транскриптом), регуляции белка (протеом) и секреции белка (секретом). Это исследование выявляет общесистемные адаптивные воспалительные состояния ЭК, подчеркивая роль взаимодействий ЭК-цитокинов в воспалительном патогенезе и еще раз подтверждая, что ЭК играют роль адаптивного игрока в воспалении.
5). b Cytoscape interaction network of receptors and potential ligands (red dots: receptors, yellow dots: ligands, purple dots: proteins fulfilling both receptor and ligand criteria), edges represent STRING-DB scores. Inserts show zooms of example cytokine-receptor interactions; for network with labels, see Supplementary Fig. 1b./p> 1). b Summarizing network of differentially abundant proteins between stimuli. Node labels show cytokine stimuli. Node size represents amount of statistically significant proteins. Edges show overlap between proteomes, color intensities (white to black) of edges indicate amount of overlapping proteins as a ratio of the smaller node. See Supplementary Fig. 3 for non-summarized network. c Profile plots of modules describing cytokine proteomic responses with cytokine annotation. Gradient scale indicated z-scores of median LFQ-score of genes in a module per stimulus, Yellow: cytokines related to an increased abundance response profile; purple: cytokine(s) related to a decreased protein abundance response, cytokines which contribute to the module regulation are highlighted. Replicates have been summarized to medians for visualization, modules are indicated by color, M1 (pink), M2 (blue), M3 (green), M4 (red) and M5 (yellow). d Proteins with high modules membership scores plotted as median label-free intensities (LFQ). e Enriched GO terms and Wikipathways per module. MF molecular function, CC cellular component, BP biological process./p> 1). d LFQ intensities of hallmark proteins per stimulation./p> 1). c Area plots of cumulative temporal dynamics of changes in the phosphoproteome (teal areas and solid lines), transcriptome (brown area and dotted lines) and proteome (purple areas and dashed lines). d Tile plot of the top enriched GO terms per stimulation: IFNγ (pink), TNFα (orange), TNFα + IFNγ (green) and omics level (as indicated). Color gradient indicated –log10 BH-adjusted p values. MF molecular function, CC cellular component, BP biological process. e Line plots of phosphorylation events, transcript levels and relative protein abundances of members of highly enriched GO:terms. Circles indicate medians; error bars show standard deviations (n = 3 biological replicates)./p>0.95) interactions. This resulted in a network containing 2306 interactions, revealing 9 high-density hubs summarized in biological processes: "Viral sensors", "Cytokines", "Complement factors", "JAK/STAT signaling", "Cell cycle", "NFKB signaling", "Proteasome", "NFKB complex" and "Antigen presentation" (Fig. 5d and Supplementary Fig. 6). Plotting the ratio of response classifications per hub, only two were majorly TNFα induced: NF-κB complex proteins (47% TNFα) and cytokines (44% TNFα), while all others were primarily IFNγ-induced. Especially the hubs, "Complement factors", "Viral sensors", "Proteasome" and "Antigen presentation" were predominantly IFNγ-induced (>75%). None of the hubs were majorly synergistically induced, suggesting synergy is confined to specific proteins and not entire biological processes./p>5-fold) (Fig. 6b). C3, crucial in the activation of the alternative pathway, is the only uniquely TNFα-induced transcript in this hub. However, whether transcript expression translated to protein increases is unclear as corresponding proteins were not detected. IFNγ also induced a strong antigen-presenting hub (Fig. 6c). We previously reported TNFα induces MHCI proteins, including HLA-A, HLA-B and HLA-C, which we observed here too36. However, these MHCI complex proteins as well as immunoproteasome (PSMB8, PSMB9 and PSMB10) and immunoproteasome regulator subunits (PSME1 and PSME2), peptide loading proteins (TAP1, TAP2, ERAP1 and ERAP2)37,38 and immune checkpoint protein Programmed death- ligand 1 (CD274) were higher induced by IFNγ compared to TNFα. Moreover, IFNγ also induced MHCII complexes required for exogenous antigen presentation. HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP transcripts were upregulated 4–7-fold at 12–24 h of IFNγ stimulation. Interestingly, in contrast to MHCI proteins, which were detected abundantly on the protein level, we were only able to detect HLA-DRA and HLA-DRB in separate LFQ workflow experiments (Supplementary Fig. 7a). To visualize the discrepancy between MHCI and MHCII protein expression, we stained BOECs for HLA-A/B/C or HLA-DR after stimulation of TNFα, IFNγ or combined stimulation. MHCI showed a clear distribution over the cell membrane, also in steady-state condition (Supplementary Fig. 7b) and in line with both transcriptome and protein data, HLA-DR was only observed in IFNγ stimulated conditions. However, in contrast to the membrane distribution of HLA-A/B/C, HLA-DR was mostly localized to compartments inside the cell (Fig. 6d)./p> 1). Colors indicate stimulus: TNFα (green), IFNγ (blue), TNFα + IFNγ (red). c Interaction network of differentially regulated proteins after 24 h TNFα + IFNγ stimulation showing protein type per hub indicated in gray. d Heatmap of enriched proteins in the cytokine registry per omics level showing correlating transcripts and proteins in lysate after TNFα, IFNγ and TNFα + IFNγ stimulation. Color gradient indicates z-scores. Several proteins are highlighted in line plots showing VST and LFQ values, error bars show standard deviation (n = 3 biological replicates). e Number of papers enriching for cell type interactions by cytokines induced per stimulation. Node size represents number of papers, per stimulus largest node is set to most cited cell type (TNFα: n citations = 566, IFNγ: n = 140, TNFα + IFNγ: n = 153)./p>95% in the total proteome./p>1./p> 1 was considered significant and relevant. For label-free secretomics data, a BH-adjusted p < 0.01 and log2 fold change > 1 was used as the significance threshold./p>0.4) were selected and annotated for Uniprot "secreted" and "signal" keywords or GO:CC "extracellular space" and "extracellular region" terms to define receptor ligands. Connections between receptors and ligands were visualized in Cytoscape 3.8.0./p>0.7 with TNFα and <0.7 with IFNγ stimulation); S2-IFNγ shape (correlation coefficient <0.7 with TNFα and >0.7 with IFNγ stimulation); S3-common shape (correlation coefficient >0.7 with TNFα and >0.7 with IFNγ stimulation) or S4-TNFα + IFNγ shape (correlation coefficient <0.3 with TNFα and <0.3 with IFNγ stimulation). Effect sizes were categorized as E1-TNFα effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation <2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation >2); E2-IFNγ effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation >2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation <2), and E3-TNFα + IFNγ effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation >2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation >2). Classifications were set to common if S3 but not E3 criteria were fulfilled; TNFα classification: S1 or S3 + E1; IFNγ classification: S2 or S3 + E2; TNFα + IFNγ classification: S3 or E3 classifications were fulfilled. If not fulfilling any shape or effect size cutoffs, classification was set to "not classified"./p>0.9 gene names were connected with edges. Edges between phosphosites, corresponding proteins and transcript were manually appended to the network. This network was visualized in Cytoscape 3.8.0. We first obtained the "EdgeBetweenness" using the "Analyse Network" function, after which we used "Edge-weighted Spring Embedded Layout" to visualize the network. We highlighted interaction hubs based on closeness of nodes, overall regulation levels and biological overlap./p>
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어
Дом